ROM-K Double Nickaseプラスミド (h): sc-404241-NIC

KCNJ1はROM-K（Kir1.1）をコードしており、腎尿細管上皮の管腔側（アピカル）膜を介したK⁺の再循環を担う内向き整流性カリウムチャネルです。これによりナトリウム再吸収とカリウム恒常性が支えられます。ROM-K活性は、ヘンレ係蹄太い上行脚および集合管における上皮横断性のイオン輸送過程と共役し、膜電位に影響を与えるとともに、起電性輸送の駆動力となります。本チャネルは、アルドステロンにより制御される輸送プログラムや細胞容積／浸透圧応答と交差する腎電解質処理経路にも関与します。KCNJ1機能の調節異常や欠失は、腎でのK⁺保持障害および酸塩基平衡の変化を特徴とする遺伝性の塩類喪失性尿細管障害と関連しており、イオン輸送異常の機序解明研究における有用な標的となります。

ROM-K ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における KCNJ1 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、KCNJ1内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、KCNJ1の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、KCNJ1が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。