RIP4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404910-ACT

Il gene umano **RIPK4** codifica la chinasi serina/treonina interagente con il recettore 4 (RIP4), una chinasi di segnalazione che agisce a valle della protein chinasi C regolando la differenziazione dei cheratinociti, la morfogenesi dell’epidermide e la formazione della barriera epiteliale. RIP4 partecipa a vie che controllano la segnalazione di NF-κB e MAPK e si integra con programmi del citoscheletro e dell’adesione che modellano l’architettura epiteliale. Un’attività deregolata di RIPK4 è stata associata ad alterazioni dell’omeostasi epiteliale, a segnalazione legata all’infiammazione e alla biologia tumorale negli epiteli squamosi, rendendola rilevante per studi sugli stati di differenziazione e sulle risposte allo stress epiteliale. La connettività delle sue vie supporta inoltre l’analisi meccanicistica dei programmi trascrizionali che governano lo sviluppo dell’epitelio stratificato e il rimodellamento associato alle malattie.

RIP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RIPK4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RIP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RIPK4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RIPK4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RIP4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RIPK4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RIP4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RIP4 nelle cellule tumorali con espressione di RIPK4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.