Plásmido CRISPR de Activación (h) Rho T1: sc-401601-ACT

RHOT1 codifica Rho T1 (Miro1), una GTPasa atípica de la familia Rho anclada a la membrana mitocondrial externa que coordina el tráfico, el posicionamiento y el control de calidad de las mitocondrias. A través de dominios EF-hand de unión a Ca2+ y de interacciones con adaptadores de quinesina/dineína, RHOT1 ayuda a acoplar las mitocondrias al transporte basado en microtúbulos y regula la dinámica mitocondrial, la homeostasis bioenergética y la mitofagia, incluidas las vías asociadas a PINK1/PRKN. La desregulación de la función de RHOT1 se ha relacionado con una distribución mitocondrial alterada y un recambio deficiente de orgánulos, procesos implicados en la neurodegeneración, las neuropatías y otros trastornos con fenotipos de estrés mitocondrial. Como regulador del transporte mitocondrial, RHOT1 se estudia con frecuencia en modelos neuronales, paradigmas de estrés oxidativo y ensayos de integridad de la red mitocondrial y de respiración.

Rho T1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RHOT1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rho T1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RHOT1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RHOT1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rho T1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RHOT1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rho T1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rho T1 en células tumorales con expresión de RHOT1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.