RFX6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-408496-ACT

RFX6 (fator regulatório X6) é um fator de transcrição do tipo hélice-alada que coordena programas de regulação gênica necessários para o desenvolvimento do pâncreas endócrino e para a manutenção da identidade das ilhotas pancreáticas. Em células humanas, o RFX6 contribui para redes transcricionais que governam a diferenciação de células beta, a função secretora de insulina e a homeostase da glicose de forma mais ampla, por meio da regulação de promotores e enhancers específicos de linhagem. Alterações na atividade de RFX6 têm sido associadas a distúrbios endócrinos congênitos do pâncreas e do intestino e a fenótipos relacionados ao diabetes, tornando-o um nó relevante para estudar destino celular endócrino, respostas ao estresse e sinalização metabólica. Como regulador nuclear, o RFX6 é comumente investigado por meio de perfis de expressão e ensaios baseados em cromatina para definir alvos a jusante e circuitos transcricionais de interação.

RFX6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RFX6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RFX6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RFX6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RFX6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RFX6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RFX6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RFX6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RFX6 em células tumorais com expressão de RFX6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.