Plasmide CRISPR d'Activation (h) Retinal RX: sc-403576-ACT

RAX (retinal homeobox) code le facteur de transcription Retinal RX, un régulateur à homéodomaine de type « paired » indispensable à la spécification précoce du champ oculaire et au maintien des progéniteurs rétiniens. Il agit en amont des programmes de différenciation des photorécepteurs et de la neurorétine en coordonnant les réseaux de régulation génique du développement et en influençant les décisions de destinée cellulaire lors du patterning du neuroectoderme. L’activité de RAX s’articule avec des voies qui contrôlent la prolifération et la différenciation dans la rétine en développement, notamment via des signaux qui affinent la morphogenèse oculaire. Une expression ou une fonction dérégulée de RAX est associée à des malformations oculaires congénitales telles que l’anophtalmie/la microphtalmie, ainsi qu’à des défauts plus larges du développement rétinien, ce qui souligne sa pertinence pour la modélisation des maladies et la recherche en biologie du développement.

Retinal RX Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAX sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Retinal RX Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAX dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAX, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Retinal RX. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAX natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Retinal RX au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Retinal RX dans les cellules tumorales présentant une expression de RAX silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.