RecQL4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403224-ACT

RECQL4 kodiert die humane RecQ-DNA-Helikase RecQL4, einen Faktor zur Aufrechterhaltung der Genomstabilität, der für die Initiation der DNA-Replikation, die Stabilisierung gestoppter Replikationsgabeln und mehrere DNA-Reparaturmechanismen erforderlich ist, darunter homologe Rekombination und Basenexzisionsreparatur. RecQL4 wirkt im Rahmen des umfassenderen Netzwerks der DNA-Schadensantwort, um während der S-Phase und nach genotoxischem Stress die chromosomale Integrität zu bewahren. Eine dysregulierte RECQL4-Aktivität wird mit Replikationsstress, chromosomaler Instabilität und einer veränderten Empfindlichkeit gegenüber DNA-schädigenden Substanzen in Verbindung gebracht und ist daher relevant für die Untersuchung von Signalwegen der Genomstabilität. Pathogene Varianten in RECQL4 sind mit erblichen Erkrankungen assoziiert, die Entwicklungsdefekte und eine Krebsprädisposition aufweisen, was seinen Einsatz in mechanistischen Modellen krankheitsassoziierter Störungen der DNA-Reparaturfunktion unterstützt.

RecQL4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RECQL4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RecQL4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RECQL4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RECQL4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RecQL4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RECQL4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RecQL4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RecQL4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RECQL4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.