Rbx1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402733-ACT

RBX1 codifica a proteína Rbx1, uma subunidade do tipo RING-box das ligases E3 de ubiquitina Cullin–RING (CRLs), que catalisam a transferência de ubiquitina para regular a degradação proteassomal de proteínas celulares-chave. Por meio do CRL1/SCF e de complexos relacionados, a Rbx1 influencia a progressão do ciclo celular, as respostas ao estresse de replicação do DNA e a transdução de sinais ao controlar a renovação (turnover) de ciclinas, inibidores de CDKs e reguladores de vias. A ubiquitinação dependente de RBX1 se integra à neddilação das culinas, acoplando a ativação das CRLs à proteostase e ao controle de checkpoints. A atividade desregulada de RBX1/CRL está associada a alterações na proliferação e na estabilidade genômica, tornando RBX1 um nó relevante para estudar sinalização oncogênica, adaptação ao estresse e vulnerabilidades da via da ubiquitina em células humanas.

Rbx1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RBX1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rbx1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RBX1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RBX1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rbx1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RBX1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rbx1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rbx1 em células tumorais com expressão de RBX1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.