RASAL3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404999-ACT

RASAL3 (RAS protein activator like 3) codifica uma proteína ativadora de GTPase de Ras que promove a conversão de Ras-GTP ativo em Ras-GDP inativo, limitando assim a amplitude e a duração da sinalização dependente de Ras. Por meio da regulação negativa de Ras/MAPK e de vias relacionadas de pequenas GTPases, o RASAL3 contribui para o controle dos estados de ativação celular, de sinais de proliferação e de programas transcricionais a jusante. Sua atividade é especialmente relevante em contextos de sinalização de células imunes, nos quais o ajuste fino da via de Ras influencia respostas acionadas por receptores e a diferenciação celular. A desregulação do controle da via de Ras está implicada em diversos processos inflamatórios e oncogênicos, tornando o RASAL3 um ponto útil para estudos mecanísticos de homeostase de sinalização.

RASAL3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RASAL3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RASAL3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RASAL3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RASAL3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RASAL3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RASAL3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RASAL3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RASAL3 em células tumorais com expressão de RASAL3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.