Rab 4A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401828-ACT

RAB4A codifica a pequena GTPase Rab4A, um regulador-chave da dinâmica dos endossomos precoces e da reciclagem rápida de cargas internalizadas de volta para a membrana plasmática. A Rab4A coordena o brotamento, a motilidade e o ancoramento de vesículas por meio de interações com efetores endossomais, influenciando o tráfego de receptores e transportadores que modulam a transdução de sinais e a composição da membrana. Ao controlar a reciclagem endocítica, RAB4A afeta processos como a renovação de receptores de fatores de crescimento, a captação de nutrientes e a remodelação do citoesqueleto. O tráfego dependente de Rab4A desregulado tem sido investigado no contexto da sinalização oncogênica, da regulação metabólica e de fenótipos neurodegenerativos, nos quais a alteração da função endossomal compromete a homeostase celular.

Rab 4A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAB4A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab 4A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAB4A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAB4A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab 4A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAB4A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab 4A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab 4A em células tumorais com expressão de RAB4A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.