Rab 14 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402109-ACT

RAB14 codifica a Rab14, uma pequena GTPase da superfamília RAS que coordena o tráfego de membranas ao alternar entre estados ligados a GDP e a GTP, controlando o brotamento, o transporte e a fusão de vesículas. A Rab14 regula a reciclagem endocítica e o transporte biossintético entre a rede trans-Golgi, endossomos iniciais/de reciclagem e a membrana plasmática, influenciando a triagem de cargas, a renovação de receptores e o tráfego polarizado. Por meio desses processos, o RAB14 contribui para a manutenção da polaridade celular, a distribuição de transportadores de nutrientes e a dinâmica da transdução de sinais. Alterações no tráfego regulado por Rab14 têm sido associadas na literatura a programas desregulados de proliferação e migração observados em múltiplos contextos de doença, tornando-o um nó útil para estudos mecanísticos de fenótipos dependentes do transporte vesicular.

Rab 14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAB14 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab 14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAB14 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAB14, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab 14. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAB14 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab 14 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab 14 em células tumorais com expressão de RAB14 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.