PSS1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404364-ACT

O PTDSS1 humano codifica a fosfatidilserina sintase 1 (PSS1), uma enzima de membrana do retículo endoplasmático que catalisa a produção de fosfatidilserina por meio de reações de troca de base, usando a fosfatidilcolina como substrato. A fosfatidilserina é um fosfolipídio aniônico central que sustenta a biogênese de membranas, o tráfego vesicular e a sinalização dependente de lipídios, além de fornecer fluxo precursor para a fosfatidiletanolamina por meio da descarboxilação mitocondrial. Ao moldar a composição e a carga da membrana, a atividade da PSS1 influencia os sítios de contato entre organelas, respostas ao estresse e vias ligadas à externalização de fosfatidilserina associada à apoptose. A desregulação do metabolismo da fosfatidilserina tem sido associada a alterações da função neuronal, fenótipos esqueléticos e distúrbios relacionados à membrana, tornando o PTDSS1 um ponto útil para estudos mecanísticos da homeostase lipídica.

PSS1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PTDSS1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PSS1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PTDSS1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PTDSS1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PSS1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PTDSS1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PSS1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PSS1 em células tumorais com expressão de PTDSS1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.