PP2Cκ CRISPR Activationプラスミド (m): sc-433975-ACT

Ppm1kはミトコンドリア型ホスファターゼであるPP2Cκをコードしている。PP2CκはMg2+/Mn2+依存性のPP2Cファミリー酵素で、分岐鎖アミノ酸（BCAA）分解（カタボリズム）に関わる主要標的を脱リン酸化することで酸化代謝を制御する。とりわけPP2Cκは、分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ（BCKDH）複合体の活性を調節し、ミトコンドリアにおける栄養フラックスと細胞のエネルギー恒常性を結び付けている。BCAA利用とミトコンドリア機能への影響を介して、Ppm1kは代謝ストレス応答や組織特異的な生体エネルギー代謝の文脈で研究されており、インスリン感受性、脂肪組織および筋代謝、ミトコンドリア機能不全に関連する表現型に関係するモデルも含まれる。実験系では、この経路の調節異常がアミノ酸恒常性の変化や、代謝疾患に関連するシグナル伝達状態の変容と関連していることが示されている。

PP2Cκ CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Ppm1kの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

PP2Cκ CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Ppm1k 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPpm1k転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性PP2Cκの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPpm1k遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるPP2Cκ依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPpm1k発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるPP2Cκ経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。