PMCA1 Double Nickaseプラスミド (h): sc-402691-NIC

ATP2B1は、細胞膜Ca2+輸送ATPアーゼ1（PMCA1）をコードしており、細胞質内カルシウム濃度を低く保ち、カルシウム依存性シグナル伝達の動態を形作る高親和性のCa2+排出ポンプである。PMCA1はATPの加水分解をCa2+の細胞外排出に結び付け、興奮性、分泌、細胞周期の進行、ならびにカルモジュリン、カルシニューリン／NFAT、CaMKシグナルに関連する経路を介したカルシウム依存性転写などの過程を支える。細胞膜近傍の局所的なCa2+マイクロドメインを制御することで、PMCA1は内皮および平滑筋の機能、ニューロンの恒常性、バリア機能の維持に影響を及ぼす。ATP2B1の遺伝学的・機能的な撹乱は、血圧調節やカルシウム取り扱い異常など、心血管および脳血管系の表現型と関連づけられており、ヒト細胞を用いた機序解明の疾患モデリングにおいて重要である。

PMCA1 ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における ATP2B1 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、ATP2B1内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、ATP2B1の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、ATP2B1が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。