PKC nu Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403822-ACT

PRKD3 codifica a proteína quinase D3 (PKC nu), uma quinase de serina/treonina que atua a jusante da sinalização de PKC dependente de diacilglicerol para regular redes de fosforilação que controlam a proliferação, a sobrevivência, a migração celular e o tráfego vesicular. A PKC nu participa da integração de sinais provenientes de GPCRs e de receptores tirosina-quinase e contribui para respostas transcricionais ligadas às vias MAPK/ERK e NF-κB, além de exercer papéis adicionais na remodelação do citoesqueleto e no transporte do Golgi para a membrana plasmática. A atividade alterada de PRKD3 tem sido associada à desregulação da sinalização por fatores de crescimento e a fenótipos invasivos em múltiplos contextos de câncer, tornando-a um nó útil para investigar a reorganização de vias oncogênicas. Em modelos de células humanas, a perturbação de PRKD3 é comumente utilizada para estudar o controle, mediado por quinases, de respostas ao estresse, programas de motilidade e regulação transcricional.

PKC nu O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRKD3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PKC nu O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRKD3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRKD3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PKC nu. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRKD3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PKC nu no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PKC nu em células tumorais com expressão de PRKD3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.