PKC eta Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402297-ACT

PRKCH codifica a proteína quinase C eta (PKCη), uma nova quinase de serina/treonina da família PKC ativada a jusante de sinalização dependente de diacilglicerol e integrada a vias mediadas por fosfolipídios. A PKCη contribui para a regulação da diferenciação de queratinócitos, do controle do crescimento de células epiteliais, da remodelação do citoesqueleto e da sinalização responsiva ao estresse, com funções dependentes do contexto em programas transcricionais ligados a MAPK e NF-κB. Em tecidos imunes e de barreira, a atividade de PRKCH influencia estados de ativação celular e as saídas de sinalização inflamatória, tornando-a relevante para estudos mecanísticos de fenótipos associados à proliferação e diferenciação desreguladas e à inflamação. Alterações na expressão ou na sinalização de PRKCH têm sido investigadas na biologia de doenças nas quais o equilíbrio de isoformas de PKC afeta o comportamento celular, sustentando seu uso como um nó funcional para interrogatório de vias.

PKC eta O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRKCH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PKC eta O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRKCH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRKCH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PKC eta. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRKCH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PKC eta no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PKC eta em células tumorais com expressão de PRKCH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.