PiT1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422988-ACT

Slc20a1 codifica o PiT1 (SLC20A1), um transportador de fosfato inorgânico dependente de sódio que sustenta a captação de fosfato necessária para a síntese de nucleótidos, o metabolismo de fosfolípidos e a homeostase energética. Para além do transporte, o PiT1 contribui para redes de sinalização que acoplam a disponibilidade de fosfato à proliferação, sobrevivência e diferenciação celulares, com ligações às vias MAPK e a outras vias associadas ao crescimento. Em sistemas murinos, a atividade de Slc20a1 é frequentemente estudada em contextos em que o manuseamento do fosfato influencia programas osteogénicos e de calcificação vascular, bem como processos de desenvolvimento e remodelação tecidular. A desregulação do transporte de fosfato e da sinalização a jusante é, portanto, relevante para estudos mecanísticos de mineralização, respostas a stress metabólico e fenótipos proliferativos.

PiT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Slc20a1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PiT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Slc20a1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Slc20a1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PiT1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Slc20a1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PiT1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PiT1 em células tumorais com expressão de Slc20a1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.