Plásmido CRISPR de Activación (h) PIF1: sc-403130-ACT

El gen humano **PIF1** codifica una helicasa de ADN 5′→3′ que ayuda a preservar la estabilidad del genoma al resolver estructuras G-cuádruplex, desenrollar intermediarios de ADN anómalos y limitar los conflictos entre replicación y transcripción. PIF1 actúa en horquillas de replicación detenidas y contribuye al reinicio de la replicación del ADN, al procesamiento de los fragmentos de Okazaki y a la supresión de recombinación inapropiada, lo que lo vincula con vías centrales de respuesta al daño del ADN y de estrés replicativo. A través de sus funciones en el metabolismo de los telómeros y en el mantenimiento del ADN mitocondrial, la alteración de la actividad de PIF1 puede influir en la integridad telomérica y en la estabilidad del genoma mitocondrial. La desregulación de estos procesos es relevante para estudios mecanísticos de los fenotipos de inestabilidad genómica observados en diversos cánceres y en otros trastornos asociados al estrés replicativo.

PIF1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PIF1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PIF1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PIF1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PIF1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PIF1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PIF1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PIF1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PIF1 en células tumorales con expresión de PIF1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.