PERK Double Nickaseプラスミド (h): sc-400080-NIC

EIF2AK3は、ER（小胞体）に局在する膜貫通型キナーゼPERKをコードしており、折りたたみ不全タンパク質の蓄積を感知して小胞体ストレス応答（unfolded protein response：UPR）を開始します。活性化されたPERKはeIF2αをリン酸化し、全体的な翻訳を抑制する一方で選択的な翻訳プログラムを促進することで、プロテオスタシス、酸化ストレス制御、ならびにオートファジー関連の適応を協調的に調節します。PERKシグナルはATF4/CHOPを介した転写応答と交差し、ER–ミトコンドリア間クロストークやレドックス恒常性にも影響します。PERK活性の制御破綻は、神経変性、代謝機能障害、腫瘍細胞のストレス適応に関与するとされる慢性的なERストレス状態と関連しており、ストレスシグナル伝達の機構研究における重要な結節点となっています。

PERK ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における EIF2AK3 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、EIF2AK3内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、EIF2AK3の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、EIF2AK3が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。