PDK3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404502-ACT

O PDK3 humano codifica a quinase da piruvato desidrogenase, isoforma 3, uma quinase mitocondrial que fosforila e inibe o complexo piruvato desidrogenase, limitando assim a entrada de piruvato no ciclo do TCA e promovendo o fluxo glicolítico. Ao controlar o equilíbrio entre a oxidação da glicose e a produção de lactato, o PDK3 contribui para a adaptação metabólica durante stress nutricional e hipóxia e influencia a homeostase redox celular. A atividade do PDK3 cruza-se com redes mais amplas de sinalização mitocondrial e de deteção de energia, moldando a fosforilação oxidativa, a anaplerose e a oxidação de ácidos gordos. A expressão desregulada de PDK3 tem sido associada à remodelação metabólica observada em contextos de biologia do cancro e de doenças neuromusculares, tornando-o um nó útil para estudar o controlo mitocondrial do destino celular e da bioenergética.

PDK3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PDK3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PDK3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PDK3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PDK3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PDK3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PDK3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PDK3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PDK3 em células tumorais com expressão de PDK3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.