PCCA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404791-ACT

PCCA codifica a subunidade alfa da propionil‑CoA carboxilase, uma enzima mitocondrial dependente de biotina que catalisa a conversão de propionil‑CoA em D‑metilmalonil‑CoA, dependente de ATP. Essa reação é essencial para o catabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada, ácidos graxos de cadeia ímpar e cadeias laterais do colesterol, conectando o uso de aminoácidos e lipídios à anaplerose mitocondrial e ao metabolismo energético. A função de PCCA se cruza com o metabolismo da biotina, a homeostase de proteínas mitocondriais e respostas ao estresse metabólico que influenciam o equilíbrio redox e o processamento de ácidos orgânicos. A interrupção patogênica da atividade de PCCA está associada à acidemia propiônica, tornando-o um alvo útil para estudar disfunção metabólica, sinalização de estresse mitocondrial e relações genótipo–fenótipo em modelos celulares humanos.

PCCA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PCCA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PCCA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PCCA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PCCA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PCCA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PCCA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PCCA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PCCA em células tumorais com expressão de PCCA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.