PC-PLD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402528-ACT

Humanes **PLD1** kodiert die Phospholipase D1 (PC‑PLD1), ein membranassoziiertes Enzym, das Phosphatidylcholin hydrolysiert und dabei Phosphatidsäure erzeugt. Diese wirkt als lipidischer Second Messenger und reguliert Membrantransport, Zytoskelett-Umbau und Vesikelsekretion. Von PLD1 gebildete Phosphatidsäure beeinflusst Signaltransduktionswege, darunter mTOR sowie Netzwerke kleiner GTPasen (ARF- und Rho-Familie), und prägt damit Endozytose, Exozytose und Rezeptorrecycling. Aufgrund seiner Funktionen bei der Thrombozytenaktivierung, entzündlicher Signalgebung und wachstumsfaktorvermittelten Antworten wurde PLD1 u. a. in Zusammenhängen wie Tumorzellinvasion, Thrombosebiologie und Neuroinflammation untersucht. Eine veränderte PLD1-Aktivität und Dynamik der Lipidsignalisierung werden außerdem mit Veränderungen der Autophagie und mitochondrialen Stressantworten in Verbindung gebracht, was PLD1 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien der zellulären Homöostase macht.

PC-PLD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PLD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PC-PLD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PLD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PLD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PC-PLD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PLD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PC-PLD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PC-PLD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PLD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.