PC-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402336-ACT

ENPP1 codifica a ectoenzima PC-1 (ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase 1), uma glicoproteína transmembranar do tipo II que hidrolisa nucleotídeos extracelulares para gerar AMP e pirofosfato inorgânico. Ao controlar a disponibilidade de pirofosfato, a PC-1 é um regulador central da mineralização da matriz extracelular e da biologia da calcificação, influenciando a sinalização osteogênica e a homeostase de fosfato nos tecidos. A atividade de ENPP1 também se relaciona com a sinalização purinérgica por meio da modulação dos pools de nucleotídeos e nucleosídeos, moldando respostas inflamatórias e metabólicas locais. A interrupção genética ou funcional de ENPP1 está associada a distúrbios de calcificação ectópica e de mineralização esquelética, e a expressão alterada de PC-1 tem sido estudada em contextos de doenças metabólicas, incluindo desregulação da sinalização da insulina.

PC-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ENPP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PC-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ENPP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ENPP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PC-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ENPP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PC-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PC-1 em células tumorais com expressão de ENPP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.