parvalbumin α Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401364-ACT

PVALB codifica a parvalbumina alfa, uma proteína de ligação ao cálcio do tipo “EF-hand” de alta afinidade que molda a dinâmica intracelular de Ca²⁺ ao acelerar o tamponamento e a relaxação de Ca²⁺ em células excitáveis. No sistema nervoso, a parvalbumina é um marcador de interneurónios GABAérgicos de disparo rápido e sustenta uma temporização precisa dos potenciais de ação e as oscilações de rede ao influenciar a libertação de neurotransmissores dependente de Ca²⁺ e a integração sináptica. Para além dos circuitos neurais, o tamponamento de cálcio pela parvalbumina contribui para a cinética de contração–relaxação no músculo e noutros processos celulares regulados por Ca²⁺. Alterações na expressão de PVALB e na função de interneurónios positivos para parvalbumina têm sido associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento e neuropsiquiátricos, tornando a regulação de PVALB relevante para estudos de excitabilidade de circuitos e sinalização dependente de cálcio.

parvalbumin α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PVALB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

parvalbumin α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PVALB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PVALB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de parvalbumin α. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PVALB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de parvalbumin α no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via parvalbumin α em células tumorais com expressão de PVALB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.