PAR4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401142-ACT

PAWR kodiert das proapoptotische Protein PAR4 (prostate apoptosis response-4), einen Leucin-Zipper-haltigen Regulator des Zellschicksals, der transkriptionelle Netzwerke und Stressantworten moduliert. PAR4 ist an intrinsischer Apoptose und Wachstumsregulation beteiligt, indem es die NF-κB-Signalübertragung, PKC/AKT-Überlebenswege und caspaseabhängige Zelltodprogramme beeinflusst, und übernimmt darüber hinaus Funktionen bei ER-Stress und der Proteostase. Eine veränderte PAWR/PAR4-Aktivität wurde mit gestörter Apoptose, der Homöostase von Epithel- und Nervenzellen sowie kontextabhängigen Zusammenhängen zur Tumorbiologie und zu neurodegenerativen Prozessen in Verbindung gebracht. Diese Funktionen machen PAWR zu einem geeigneten Knotenpunkt, um das Zusammenspiel zwischen Überlebenssignalwegen, Transkriptionsregulation und programmiertem Zelltod zu untersuchen.

PAR4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PAWR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PAR4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PAWR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PAWR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PAR4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PAWR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PAR4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PAR4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PAWR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.