PAF acetylhydrolase 2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410924-ACT

PAFAH2 codifica a PAF acetil-hidrolase 2, uma fosfolipase A2 citosólica que hidrolisa o fator ativador de plaquetas (PAF) e fosfolipídios oxidados, modulando assim a sinalização de lipídios bioativos e a homeostase dos lipídios de membrana. Ao limitar a sinalização induzida por PAF e remover fosfolipídios peroxidados, a PAFAH2 contribui para a regulação de respostas inflamatórias, do estresse oxidativo e de vias a jusante ligadas à sobrevivência celular e ao remodelamento lipídico. O controle alterado de PAF e de mediadores lipídicos oxidados tem sido associado a desregulação da sinalização imune e a fenótipos de estresse metabólico, tornando a PAFAH2 relevante para estudos mecanísticos de disfunção celular associada à inflamação.

PAF acetylhydrolase 2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PAFAH2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PAF acetylhydrolase 2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PAFAH2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PAFAH2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PAF acetylhydrolase 2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PAFAH2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PAF acetylhydrolase 2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PAF acetylhydrolase 2 em células tumorais com expressão de PAFAH2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.