PABPN1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403802-ACT

A PABPN1 humana (poly(A) binding protein nuclear 1) é uma proteína nuclear de ligação a RNA expressa de forma ubíqua, que se associa à cauda poli(A) para regular o processamento da extremidade 3′ do mRNA, a poliadenilação e a estabilidade dos transcritos. Ao influenciar o controlo do comprimento da cauda poli(A) e a maturação do RNA, a PABPN1 contribui para programas globais de expressão génica e para o metabolismo de RNA no núcleo. A desregulação ou mutação de PABPN1 perturba o processamento de RNA e as vias de proteostase e está associada a patologia do músculo esquelético, sobretudo à distrofia muscular oculofaríngea (OPMD). Como componente central da regulação pós-transcricional, a PABPN1 é amplamente estudada em mecanismos de controlo de qualidade do RNA, renovação/degradação de RNA nuclear e alterações no processamento de mRNA associadas ao stress.

PABPN1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PABPN1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PABPN1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PABPN1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PABPN1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PABPN1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PABPN1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PABPN1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PABPN1 em células tumorais com expressão de PABPN1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.