p55 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409649-ACT

O MPP1 humano codifica a proteína de membrana palmitoilada p55, um fator de ancoragem (scaffold) da família MAGUK que ajuda a organizar complexos proteicos associados à membrana e a acoplá-los ao citoesqueleto cortical de actina–espectrina. A p55 participa da estabilidade das junções e da arquitetura de domínios de membrana por meio de interações com proteínas contendo domínio FERM e outros adaptadores do citoesqueleto, influenciando a forma celular, a polaridade e o tráfego intracelular. Em eritrócitos, o MPP1 contribui para a integridade mecânica da membrana e para a organização de microdomínios especializados, processos relevantes para a deformabilidade das hemácias e para fenótipos de estabilidade da membrana. Alterações na ancoragem dependente de p55 têm sido investigadas em contextos nos quais a ancoragem ao citoesqueleto e a regulação de contatos célula–célula estão perturbadas, oferecendo uma base para estudar a organização de membranas em estados normais e associados a doenças.

p55 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MPP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

p55 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MPP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MPP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de p55. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MPP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de p55 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via p55 em células tumorais com expressão de MPP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.