OCT2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402053-ACT

SLC22A2 codifica il trasportatore di cationi organici 2 (OCT2), un trasportatore di soluti a specificità ampia che media l’assorbimento elettrogenico di ammine endogene e di cationi organici xenobiotici attraverso la membrana plasmatica. Nell’uomo, OCT2 è particolarmente rilevante nel trasporto del tubulo prossimale renale, dove contribuisce alla secrezione vettoriale e all’esposizione cellulare ai composti trasportati, influenzando la distribuzione intracellulare e le risposte di stress mitocondriale o ossidativo. L’attività di OCT2 si integra con reti più ampie di detossificazione e farmacocinetica modulando la disponibilità dei substrati per il metabolismo di fase I/II e per i trasportatori di efflusso. La variabilità o la disregolazione di SLC22A2 è stata associata a differenze interindividuali nella gestione dei farmaci e nella suscettibilità a tossicità mediate da trasportatori, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici in biologia renale ed epiteliale.

OCT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC22A2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OCT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC22A2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC22A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OCT2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC22A2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OCT2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OCT2 nelle cellule tumorali con espressione di SLC22A2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.