Nox4 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-424443-ACT-2

Il gene murino Nox4 (NADPH ossidasi 4) codifica un enzima costitutivamente attivo che genera specie reattive dell’ossigeno (ROS), producendo principalmente perossido di idrogeno e modulando la segnalazione redox in molteplici tipi cellulari. Le ROS derivate da NOX4 regolano vie di segnalazione tra cui TGF-β/SMAD, MAPK, PI3K–AKT e NF-κB, influenzando processi quali differenziamento, rimodellamento della matrice extracellulare, apoptosi e risposte allo stress, con ruoli rilevanti nella biologia vascolare, nella funzione renale e nell’attivazione dei fibroblasti. Un’attività di Nox4 deregolata è stata associata, in modelli murini, a fenotipi sperimentali pertinenti a fibrosi, ipertensione e rimodellamento vascolare, disfunzione metabolica e danno tissutale infiammatorio. L’editing genetico di Nox4 consente di chiarire i meccanismi della segnalazione ROS compartimentalizzata, di investigare programmi trascrizionali dipendenti dallo stato redox e di validare il contributo di NOX4 in sistemi cellulari e in vivo rilevanti per la malattia.

Nox4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nox4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nox4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nox4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nox4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nox4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nox4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nox4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nox4 nelle cellule tumorali con espressione di Nox4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.