NOS2/iNOS Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421928-ACT

Il gene murino Nos2 codifica la sintasi dell’ossido nitrico inducibile (NOS2/iNOS), un enzima responsivo all’infiammazione che catalizza la produzione di ossido nitrico a partire da L-arginina, modulando l’equilibrio redox e la difesa antimicrobica. iNOS è regolata a livello trascrizionale a valle della segnalazione dell’immunità innata, incluse le vie dipendenti da NF-κB e dagli interferoni, e contribuisce alla polarizzazione dei macrofagi e alle reti citochiniche. Un’attività sostenuta di NOS2 può favorire stress nitrosativo, S-nitrosilazione delle proteine e danno al DNA, collegando una segnalazione dell’ossido nitrico deregolata alla lesione tissutale infiammatoria e a modificazioni della biologia del microambiente tumorale. Nos2 è ampiamente utilizzato come readout funzionale di cellule mieloidi attivate e come nodo meccanicistico che connette la stimolazione immunitaria alle risposte metaboliche e allo stress ossidativo.

NOS2/iNOS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nos2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NOS2/iNOS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nos2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nos2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NOS2/iNOS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nos2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NOS2/iNOS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NOS2/iNOS nelle cellule tumorali con espressione di Nos2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.