NORRIN Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405323-ACT

Il gene umano **NDP** codifica la proteina secreta **NORRIN**, un ligando Wnt atipico che si lega a **Frizzled-4** e **LRP5/6** per attivare la segnalazione Wnt canonica mediata da **β-catenina**. Questa via sostiene lo sviluppo e il mantenimento del sistema vascolare nella retina e nell’orecchio interno, influenzando le interazioni tra endotelio e periciti, l’integrità della barriera e l’omeostasi neurovascolare. Una deregolazione della segnalazione **NDP/NORRIN** è associata a vitreoretinopatie ereditarie e a difetti della vascolarizzazione retinica, ed è spesso studiata nel contesto del rimodellamento angiogenico e delle reti di segnalazione neuroevolutiva. La modulazione sperimentale dell’espressione di **NDP** offre un approccio gestibile per analizzare il crosstalk della via Wnt, i programmi trascrizionali a valle della **β-catenina** e le risposte specifiche dei diversi tipi cellulari in modelli oculari e vascolari.

NORRIN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NDP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NORRIN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NDP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NDP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NORRIN. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NDP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NORRIN nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NORRIN nelle cellule tumorali con espressione di NDP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.