NIPBL Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-427895-ACT

O gene Nipbl de camundongo codifica a NIPBL, um fator de carregamento de coesina que posiciona o complexo de coesina na cromatina para sustentar a coesão entre cromátides-irmãs, a replicação do DNA e a segregação cromossômica. Além da mitose, a NIPBL ajuda a organizar a arquitetura genômica de ordem superior e regula programas transcricionais do desenvolvimento ao influenciar a comunicação entre enhancers e promotores. Por meio dessas funções, ela impacta vias ligadas à estabilidade do genoma e às decisões de destino celular, incluindo respostas ao estresse replicativo e ao reparo de quebras de dupla fita. A desregulação da função de NIPBL está associada a fenótipos relacionados a coesinopatias e tem sido usada para modelar mecanismos subjacentes a anormalidades de neurodesenvolvimento e de crescimento in vivo e em sistemas baseados em células.

NIPBL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Nipbl sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NIPBL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Nipbl em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Nipbl, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NIPBL. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Nipbl nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NIPBL no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NIPBL em células tumorais com expressão de Nipbl silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.