nephrocystin-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406788-ACT

NPHP3 codifica a nefrocistina-3, uma proteína associada aos cílios que se localiza no cílio primário e na região do centrossoma, onde contribui para a ciliogénese, a sinalização ciliar e a manutenção da polaridade epitelial. A nefrocistina-3 participa em complexos proteicos na zona de transição do cílio, que regulam o tráfego de recetores de sinalização e influenciam vias como Hedgehog e Wnt, dependentes de uma função ciliar intacta. A perturbação de processos dependentes de NPHP3 pode comprometer a sinalização mecanossensorial e do desenvolvimento em epitélios renais e noutros tecidos, relacionando o seu estudo com os mecanismos das ciliopatias. Como resultado, o NPHP3 é um alvo útil para investigar a transdução de sinal mediada por cílios, a tubulogénese e as relações genótipo–fenótipo em modelos celulares humanos.

nephrocystin-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NPHP3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

nephrocystin-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NPHP3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NPHP3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de nephrocystin-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NPHP3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de nephrocystin-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via nephrocystin-3 em células tumorais com expressão de NPHP3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.