NEDL2 CRISPR Activationプラスミド (m): sc-435931-ACT

マウス Hecw2 は NEDL2 をコードしており、NEDL2 は HECT 型の E3 ユビキチンリガーゼとして、基質タンパク質の安定性や局在をユビキチン依存的に制御することで、タンパク質代謝回転やシグナル伝達の出力を調節します。NEDL2 の活性はプロテオスタシスの維持に寄与し、主要な制御タンパク質のユビキチン化を調節することで、神経発生、シナプス機能、ストレス応答性転写を司る経路に影響を与え得ます。ユビキチン介在性の制御における役割から、Hecw2 は神経発達および神経行動表現型、ならびにユビキチンシグナルの破綻に関するより広範な機構の文脈で研究されています。このため Hecw2 は、マウス細胞モデルにおいて E3 リガーゼが細胞状態の遷移やネットワークレベルのシグナル伝達をどのように微調整するかを解析するための有用な標的となります。

NEDL2 CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Hecw2の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

NEDL2 CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Hecw2 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はHecw2転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性NEDL2の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のHecw2遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるNEDL2依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびHecw2発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるNEDL2経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。