NCCT CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402965-ACT

SLC12A3 は、遠位尿細管（distal convoluted tubule）上皮細胞の管腔側（頂端）膜に局在する、電気的に中性な Na⁺/Cl⁻ 共輸送体である NCCT（NCC）をコードしており、ナトリウムおよび塩化物の再吸収を担うことで、電解質恒常性と血圧調節に寄与します。NCCT の活性は、WNK–SPAK/OSR1 キナーゼシグナル伝達を含む腎臓の塩取り扱いネットワークと統合されており、輸送体のリン酸化、トラフィッキング、ならびに膜上発現量が制御されます。SLC12A3 の遺伝的多様性や発現変化は、ギテルマン症候群などの遺伝性塩喪失性尿細管障害と関連し、高血圧の感受性や腎電解質表現型との関係も検討されてきました。腎臓に豊富に発現する輸送体として、NCCT はヒトモデル系における上皮イオン輸送、細胞極性、浸透圧調節シグナルを研究するための扱いやすい標的（ノード）となります。

NCCT CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性SLC12A3の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

NCCT CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における SLC12A3 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はSLC12A3転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性NCCTの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のSLC12A3遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるNCCT依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびSLC12A3発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるNCCT経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。