NARC-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402445-ACT

O PCSK9 codifica a protease serina secretada NARC-1, um regulador pós-traducional central da homeostase do colesterol, por meio do controle da abundância do receptor de LDL (LDLR) na superfície dos hepatócitos. Ao promover a internalização e a degradação lisossomal do LDLR, o PCSK9 modula a reciclagem do receptor e influencia a captação de lipoproteínas, integrando-se a programas metabólicos de lipídios dirigidos por SREBP. A expressão e a atividade do PCSK9 cruzam-se com o tráfego do retículo endoplasmático para o Golgi, o processamento na via secretória e a dinâmica extracelular de receptor–ligante. A desregulação da sinalização de PCSK9 está fortemente associada a alterações do colesterol LDL plasmático e à suscetibilidade a doenças cardiometabólicas, tornando-o um alvo amplamente utilizado em estudos mecanísticos de regulação lipídica.

NARC-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PCSK9 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NARC-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PCSK9 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PCSK9, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NARC-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PCSK9 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NARC-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NARC-1 em células tumorais com expressão de PCSK9 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.