NAG Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412223-ACT

NBAS umano codifica la proteina NAG, un componente del complesso di tethering NRZ che supporta il traffico retrogrado mediato da COPI dal Golgi al reticolo endoplasmatico e contribuisce a preservare l’omeostasi di RE e Golgi. Attraverso il suo ruolo nel tethering delle vescicole e nel traffico di membrana, NBAS influenza la funzione della via secretoria e la proteostasi cellulare, con effetti a valle sulle risposte allo stress e sul metabolismo. Alterazioni genetiche di NBAS sono state associate a fenotipi multisistemici, inclusi episodi ricorrenti di insufficienza epatica acuta spesso scatenati da malattie febbrili, evidenziandone l’importanza per la resilienza degli epatociti e per il controllo omeostatico sistemico. Queste caratteristiche rendono NBAS un bersaglio utile per studiare la dinamica della via secretoria precoce, la comunicazione tra organelli e i programmi trascrizionali di adattamento allo stress.

NAG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NBAS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NAG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NBAS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NBAS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NAG. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NBAS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NAG nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NAG nelle cellule tumorali con espressione di NBAS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.