Plasmide CRISPR d'Activation (h) MtRPOL: sc-403497-ACT

Le gène humain **POLRMT** code l’ARN polymérase mitochondriale (MtRPOL), une enzyme codée par le noyau responsable de la transcription du génome mitochondrial afin de produire les ARNr, les ARNt et les ARNm nécessaires à la phosphorylation oxydative. MtRPOL fonctionne au sein de l’appareil de transcription mitochondrial aux côtés de TFAM et TFB2M, et est étroitement liée au maintien de l’ADN mitochondrial, à la biogenèse des ribosomes et à l’assemblage de la chaîne respiratoire. En contrôlant l’expression des gènes mitochondriaux, POLRMT soutient la production d’ATP, l’homéostasie rédox et les réponses au stress associées aux voies de contrôle qualité mitochondriales. La dérégulation de la transcription mitochondriale et de l’activité de POLRMT est associée à une altération de la bioénergétique et est pertinente pour l’étude des maladies mitochondriales et des dysfonctionnements mitochondriaux liés à la neurodégénérescence.

MtRPOL Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POLRMT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MtRPOL Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POLRMT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POLRMT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MtRPOL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POLRMT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MtRPOL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MtRPOL dans les cellules tumorales présentant une expression de POLRMT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.