Plasmide CRISPR d'Activation (h) mTOR: sc-400140-ACT

MTOR code mTOR, une kinase sérine/thréonine qui intègre la disponibilité en nutriments, la signalisation des facteurs de croissance, l’état énergétique cellulaire et les signaux de stress afin de coordonner des programmes anaboliques et cataboliques. En tant que cœur catalytique de mTORC1 et mTORC2, mTOR régule la synthèse protéique via S6K et 4E-BP1, la biosynthèse des lipides et des nucléotides, l’autophagie, la fonction lysosomale, l’organisation du cytosquelette et la survie cellulaire, par des voies qui recoupent la signalisation PI3K–AKT. Un contrôle strict de l’activité de mTOR est essentiel à la croissance cellulaire, au métabolisme et à l’homéostasie immunitaire, tandis qu’une dérégulation est fréquemment associée à une prolifération altérée, une reprogrammation métabolique et une autophagie aberrante. Des perturbations de la signalisation MTOR ont été liées à divers contextes pathologiques, notamment la biologie des cancers, des processus neurodéveloppementaux et neurodégénératifs, ainsi que des phénotypes métaboliques et inflammatoires.

mTOR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MTOR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

mTOR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MTOR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MTOR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de mTOR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MTOR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de mTOR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie mTOR dans les cellules tumorales présentant une expression de MTOR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.