MTMR5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410999-ACT

SBF1 codifica a MTMR5, uma pseudofosfatase relacionada às miotubularinas cataliticamente inativa, que atua como uma proteína de suporte (scaffold) na sinalização por fosfoinositídeos e no tráfego de membranas endossomais. A MTMR5 interage com miotubularinas ativas, como a MTMR2, para regular a homeostase do fosfatidilinositol 3-fosfato e do fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato, influenciando a dinâmica endossomo–lisossomo, a renovação (turnover) de receptores e a organização do citoesqueleto. Por meio desses processos, a SBF1 tem sido associada a vias que controlam a mielinização, a manutenção axonal e as respostas ao estresse celular. Variações genéticas e expressão desregulada nesse eixo estão associadas a fenótipos de neuropatias hereditárias e a contextos mais amplos de neurodesenvolvimento e biologia tumoral, nos quais a sinalização dependente de tráfego se encontra alterada.

MTMR5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SBF1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MTMR5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SBF1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SBF1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MTMR5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SBF1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MTMR5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MTMR5 em células tumorais com expressão de SBF1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.