MISP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409029-ACT

O MISP humano (posicionamento do fuso mitótico) codifica uma proteína associada à actina e aos microtúbulos que contribui para a orientação do centrossoma e do fuso, a progressão mitótica e a manutenção da arquitetura epitelial. O MISP integra a remodelação do citoesqueleto com o controlo do ciclo celular ao coordenar a dinâmica da actina cortical, a sinalização associada às adesões focais e a formação adequada de um fuso bipolar, para garantir uma segregação cromossómica precisa. O posicionamento desregulado do fuso e a organização do citoesqueleto estão amplamente associados à instabilidade cromossómica e a alterações da polaridade dos tecidos, tornando o MISP um alvo relevante para estudar mecanismos que acoplam adesão, polaridade e divisão. Em investigação biomédica, a modulação da expressão de MISP é usada para analisar a fidelidade mitótica, o controlo da forma celular e dependências de vias de sinalização em modelos celulares humanos transformados e não transformados.

MISP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MISP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MISP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MISP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MISP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MISP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MISP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MISP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MISP em células tumorais com expressão de MISP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.