MGMT CRISPR Activationプラスミド (h): sc-400720-ACT

MGMT（O6-methylguanine-DNA methyltransferase）は、保存性の高いDNA修復タンパク質であり、グアニンのO6位に形成されたアルキル付加体を直接修復（direct reversal）機構によって除去します。これにより塩基対形成の正確性が回復され、変異誘発が抑制されます。MGMTは、アルキル基を活性部位のシステインへ転移させる「自殺酵素」として機能し、内因性・外因性のアルキル化ストレスに対する細胞応答に影響するとともに、細胞周期の進行やDNA損傷シグナル伝達を形作るゲノム維持プログラムとも連携します。MGMTの発現量やプロモーター制御の変動は、さまざまな疾患文脈において変異蓄積やゲノム不安定性への感受性の変化と関連付けられており、DNA修復能を研究するうえで重要な結節点となっています。さらにMGMTは、遺伝毒性ストレス耐性を制御する経路や、DNA修復遺伝子発現のエピジェネティック制御に関わる経路において、機能的な指標（readout）として広く用いられています。

MGMT CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性MGMTの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

MGMT CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における MGMT 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はMGMT転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性MGMTの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のMGMT遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるMGMT依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびMGMT発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるMGMT経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。