mEH Double Nickaseプラスミド (h): sc-404239-NIC

ヒトEPHX1は、ミクロソーム型エポキシド加水分解酵素（mEH）をコードしている。mEHは小胞体に局在する酵素で、反応性の高いエポキシドをより反応性の低いジオールへ加水分解し、外因性化学物質（キセノバイオティクス）や内因性脂質エポキシドの細胞内での処理のあり方を規定する。mEHは、酸化ストレス応答、レドックス恒常性、炎症性シグナル伝達と交差する第I相／第II相代謝ネットワークに関与し、解毒能に関連する下流経路に影響を与える。EPHX1活性の個体差は、化学物質曝露に対する感受性の違いや、生理活性をもつエポキシド中間体の調節との関連で研究されている。生物医学研究では、EPHX1が代謝表現型、細胞のストレス耐性、ならびに脂質メディエーターシグナルに影響する経路間クロストークに与える影響が、しばしば解析対象となる。

mEH ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における EPHX1 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、EPHX1内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、EPHX1の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、EPHX1が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。