MDM2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400045-ACT

MDM2 kodiert eine E3-Ubiquitin-Ligase, die als zentraler negativer Regulator von TP53 wirkt, indem sie die Ubiquitinierung von p53 sowie dessen nukleären Export und proteasomalen Abbau fördert, um DNA-Schadensantworten zu begrenzen. Über Feedback-Regulation und die Einbindung in die ATM/ATR-Signalübertragung beeinflusst MDM2 Zellzyklus-Checkpoints, Apoptose, Seneszenz und stressadaptive transkriptionelle Programme. Eine dysregulierte MDM2-Expression oder -Aktivität kann die Ausgabe des p53-Signalwegs verschieben und wird häufig in Krebsarten untersucht, in denen veränderte Proteostase und Checkpoint-Kontrolle zur Fitness von Tumorzellen beitragen. MDM2 ist zudem mit weiteren Netzwerken verknüpft, darunter RB/E2F-vermittelte Proliferation und PI3K–AKT-Signaling, was es zu einem nützlichen Knotenpunkt für Pathway-Mapping und funktionelle Genomik macht.

MDM2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MDM2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MDM2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MDM2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MDM2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MDM2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MDM2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MDM2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MDM2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MDM2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.