MATH-5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-415110-ACT

ATOH7 codifica o fator de transcrição bHLH (basic helix–loop–helix) MATH-5, um regulador-chave da neurogênese retiniana que promove a competência e a diferenciação de células ganglionares da retina, ao mesmo tempo que influencia decisões mais amplas de linhagem neuronal. MATH-5 integra-se a redes transcricionais do desenvolvimento envolvendo a sinalização Notch, fatores bHLH neurogênicos e programas a jusante de orientação axonal e saída do ciclo celular, para coordenar o momento da especificação neuronal. A expressão ou função desregulada de ATOH7 está ligada a alterações no desenvolvimento da retina e tem sido associada a anomalias congênitas do nervo óptico e da retina, bem como à suscetibilidade a distúrbios visuais do neurodesenvolvimento. Como um nó no padrão inicial do campo ocular e na determinação do destino neuronal, ATOH7 é amplamente utilizado para investigar circuitos regulatórios gênicos que governam a formação de neurônios sensoriais.

MATH-5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATOH7 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MATH-5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATOH7 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATOH7, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MATH-5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATOH7 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MATH-5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MATH-5 em células tumorais com expressão de ATOH7 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.