MANEAL CRISPR Activationプラスミド (h): sc-414652-ACT

MANEAL は、機能が十分に解明されていない膜関連タンパク質をコードしており、エンドメンブレン系コンパートメントに局在すると予測されています。また、分泌経路における細胞内輸送やタンパク質の取り扱いに寄与する可能性があります。近年のアノテーションやドメイン情報からは、ER–ゴルジ体輸送や膜の組織化、ひいてはプロテオスタシスや細胞ストレス応答に影響する過程との関連が示唆されています。そのため MANEAL は、エンドメンブレン動態が増殖・分化などの細胞状態の制御をどのように形作るかを理解するうえで注目されています。さらに、ゲノム／トランスクリプトームデータセットにおいて発現変動が報告されていることから、特に分泌経路の恒常性が損なわれたモデルにおいて、疾患関連の細胞表現型に対する文脈依存的モジュレーターとして MANEAL を検証する意義が高まっています。

MANEAL CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性MANEALの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

MANEAL CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における MANEAL 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はMANEAL転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性MANEALの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のMANEAL遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるMANEAL依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびMANEAL発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるMANEAL経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。