MANEA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-413213-ACT

MANEA (manoosidase endo-α) codifica uma endo-α-1,2-manoosidase residente no Golgi que remove resíduos de N-glicanos de alto teor de manose glicosilados durante a maturação de glicoproteínas. Ao oferecer uma alternativa ao processamento dependente de glicosidases do retículo endoplasmático (RE), a MANEA ajuda a coordenar o controle de qualidade da glicosilação N-ligada e influencia o dobramento, o tráfego e a secreção de proteínas. Essa atividade relaciona a MANEA à homeostase da via secretora e às redes de proteostase que moldam a composição de receptores na superfície celular e os resultados de sinalização. A desregulação do processamento de glicanos tem sido associada a alterações no reconhecimento imune, a fenótipos metabólicos e a uma patobiologia mais ampla em que a maturação e o tráfego de glicoproteínas estão comprometidos.

MANEA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MANEA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MANEA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MANEA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MANEA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MANEA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MANEA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MANEA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MANEA em células tumorais com expressão de MANEA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.