Plasmide CRISPR d'Activation (h) LOC285636: sc-415435-ACT

C5orf51 (LOC285636) est un locus humain encore mal caractérisé, qui semble coder une protéine de faible abondance et ne dispose que d’une annotation fonctionnelle limitée dans les bases de données actuelles. Des observations récentes au niveau des transcrits suggèrent une expression dépendante du type cellulaire et du contexte, ce qui indique des rôles potentiels dans des réseaux régulateurs qui façonnent l’état cellulaire plutôt que dans le métabolisme d’entretien de base. Comme pour de nombreux cadres de lecture ouverts non caractérisés, des profils d’expression altérés ont été rapportés dans plusieurs jeux de données issus de contextes pathologiques variés, ce qui motive sa priorisation pour des études mécanistiques de la régulation génique et des associations avec des phénotypes. Définir la fonction de LOC285636 peut aider à cartographier les mécanismes de contrôle transcriptionnel en amont ainsi que les effets en aval sur les voies de signalisation, pertinents pour la prolifération, les réponses au stress et les programmes de différenciation cellulaire.

LOC285636 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de C5orf51 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LOC285636 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus C5orf51 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription C5orf51, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LOC285636. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus C5orf51 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LOC285636 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LOC285636 dans les cellules tumorales présentant une expression de C5orf51 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.