LITAF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404337-ACT

LITAF (fattore TNF indotto da lipopolisaccaride) è un regolatore trascrizionale coinvolto nella segnalazione dell’immunità innata e nell’espressione di geni infiammatori, inclusa la modulazione del TNF e di altri programmi responsivi alle citochine. La proteina interagisce con vie di rilevamento dello stress e dei patogeni e contribuisce ai processi di traffico endosomiale/lisosomiale che influenzano il turnover dei recettori e gli output di segnalazione a valle. Un’alterata attività di LITAF è stata associata a infiammazione disregolata e a risposte cellulari allo stress, e perturbazioni genetiche sono state collegate a fenotipi neuropatici e immuno-correlati. Queste caratteristiche rendono LITAF un nodo utile per studiare il controllo trascrizionale delle reti di citochine, il crosstalk tra traffico di membrana e infiammazione e la regolazione dipendente dal contesto dell’omeostasi immunitaria.

LITAF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LITAF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LITAF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LITAF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LITAF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LITAF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LITAF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LITAF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LITAF nelle cellule tumorali con espressione di LITAF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.