Limkain b1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411308-ACT

KIAA0430 codifica Limkain b1, una proteina umana coinvolta nell’organizzazione del citoscheletro e in processi associati all’actina che modellano morfologia, adesione e motilità cellulare. Gli studi sulle proteine della famiglia Limkain suggeriscono collegamenti con vie di segnalazione che accoppiano la dinamica di membrana al rimodellamento dell’actina, favorendo cambiamenti coordinati dell’architettura cellulare. Un’alterata regolazione delle reti actina-citoscheletro è spesso associata, nel cancro, a fenotipi di proliferazione, migrazione e invasione disregolati e, in contesti di neurosviluppo, a una connettività neuronale compromessa. Caratterizzare l’espressione e la funzione di Limkain b1 può aiutare a chiarire come il controllo del citoscheletro si integri con programmi trascrizionali e di segnalazione più ampi, rilevanti per transizioni dello stato cellulare associate a malattia.

Limkain b1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KIAA0430 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Limkain b1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KIAA0430 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KIAA0430, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Limkain b1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KIAA0430 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Limkain b1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Limkain b1 nelle cellule tumorali con espressione di KIAA0430 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.